实操详解丨贴壁细胞的培养方法④细胞复苏

细胞的传代培养实验步骤

（1）取出存放在液氮中的细胞冻存管，握住管顶端放在37 ℃水浴中匀速震荡溶解，直至有黄豆粒大小时快速移至超净台内，防止二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）损伤细胞。

（2）在15 mL离心管加入5 mL 10% FBS新鲜培养液，将冻存管中液体转移至离心管内，低速离心机内1 000 rpm离心5 min，弃上清；

（3）随后加入1 mL新鲜培养液重悬细胞，将重悬的细胞悬液转移到已有5 mL新鲜培养液的10 cm细胞培养皿中，“∞”摇匀，观察细胞均匀分散后放入细胞培养箱静置培养。

注意：

（1）预热培养用液：使用前把已经配制好的装有培养液、PBS和胰蛋白酶的离心管​提前从4℃拿出防止室温预热；

（2）用75%酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手；

（3）正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且减少污染；

（4）点燃酒精灯：注意火焰不能太小，保证操作环境周围无菌；

（5）严格的无菌操作；

（6）贴壁细胞消化适度：消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响，消化过程中应该注意培养细胞形态的变化，一旦胞质回缩，连接变松散，或有成片浮起的迹象就要立即终止消化；

（7）传代细胞所有的操作尽量靠近酒精灯火焰。每次最好只进行一种细胞的操作，每种细胞使用一套器材。避免交叉感染；

（8）传代细胞瓶口，培养液的瓶口等每次打开或者关闭都需要在酒精灯上消毒。

（9）一天观察细胞次数最好在1-2次，频繁观察细胞容易破坏细胞稳态，不利益细胞生长；

（10）装有已经配制好的装有培养液、PBS和胰蛋白酶的离心管使用后注意在酒精灯上消毒，并且用封口膜封口。

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